Proteolytic activity and degradation of bovine versus human dentin matrices

Abstract Non-human teeth have been commonly used in research as replacements for human teeth, and potential dissimilarities between the dental tissues should be considered when interpreting the outcomes. Objective: To compare the proteolytic activity and degradation rate of bovine and human dentin matrices. Methodology: Dentin beam specimens were obtained from human molars (n=30) and bovine incisors (n=30). The beams were weighed hydrated and after complete dehydration to obtain the mineralized wet and dry masses. Then, the beams were demineralized in 10 wt% phosphoric acid. Next, 15 beams from each substrate were randomly selected and again dehydrated and weighed to obtain the initial demineralized dry mass (DM). Then, the beams were stored in saliva-like buffer solution (SLBS) for 7, 14 and 21 days. SLBS was used to evaluate hydroxyproline (HYP) release after each storage period. The remaining beams of each substrate (n=15) were tested for initial MMP activity using a colorimetric assay and then also stored in SLBS. DM and MMP activity were reassessed after 7, 14 and 21 days of incubation. The data were subjected to two-way ANOVA tests with repeated measures complemented by Bonferroni's tests. Unpaired two-tailed t-tests were also used (p<0.05). Results: Similar water and inorganic fractions were found in human and bovine dentin, while human dentin had a higher protein content. The most intense proteolytic activity and matrix deterioration occurred short after dentin was demineralized. Both substrates exhibited a sharp reduction in MMP activity after seven days of incubation. Although human dentin had higher MMP activity levels, greater HYP release and DM loss after seven days than bovine dentin, after 14 and 21 days, the outcomes were not statistically different. Conclusion: Bovine dentin is a suitable substrate for long-term studies involving the degradation of dentin matrices.

Redução da atividade proteolítica da dentina após curtos períodos de aplicação de proantocianidina / Reduction of the dentin proteolytic activity after short periods of application of proanthocyanidin

Introdução: Agentes promotores de ligações cruzadas têm sido investigados como inibidores da atividade enzimática da dentina, o que favoreceria a longevidade das restaurações adesivas. Objetivo: Avaliar o efeito do tratamento da dentina com proantocianidina (PA), em curtos períodos de tempo, na inibição da atividade de MMPs in situ. Material e método: Quarenta espécimes de dentina (1×1×6 mm) foram obtidos de molares hígidos e divididos em quatro grupos (n=10). Os espécimes foram condicionados com ácido fosfórico por 15 s, seguido de lavagem em água deionizada. A dentina condicionada foi tratada com: água, 5% PA por 5 s, 15 s ou 30 s. A atividade de MMP foi analisada colorimetricamente (SensoLyte®) e os dados de absorbância (412 nm) foram submetidos aos testes de ANOVA e Tukey (alfa =0,05). Resultado: Todos os períodos de tratamento foram capazes de reduzir a atividade de MMPs, sendo que os melhores resultados foram observados para a dentina tratada com PA por 15 s (63,1% redução) e 30 s (70,2%). O tratamento por 5 s foi capaz de inibir 39,9% das MMPs. Conclusão: A aplicação de PA sobre a dentina condicionada foi capaz de reduzir a atividade de MMPs mesmo em períodos de tempo extremamente curtos, como 5 s. No entanto, melhores resultados foram obtidos com os maiores períodos de tratamento.

Introduction: Collagen cross-linkers have been investigated as inhibitors of the enzymatic activity of dentin, therefore improving the longevity of adhesive restorations. Purpose: To evaluate the effect of etched dentin treatment with proanthocyanidin (PA) in short periods of time on the inhibition of dentin metalloproteinases (MMP) activity in situ. Material and method: Forty dentin specimens (1x1x6mm) were obtained from sound third molars and divided into 4 groups (n=10). The specimens were etched with 37% phosphoric acid for 15s and rinsed in deionized water. Then they were treated with the following solutions: water, 5% PA for 5s, 15s or 30s. The total MMP activity was analyzed by a colorimetric test (SensoLyte®). Absorbance data (412nm) were submitted to ANOVA and Tukey tests (alfa =0.05). Result: All treatment periods were able to reduce the total activity of MMPs. The best results were observed for dentine treated with PA for 15s (63.1% reduction) and 30s (70.2%). Treatment for 5s was capable of inhibiting only 39.9% of the total MMP activity. Conclusion: Application of PA on the etched dentin in extremely short periods of time reduced the MMPs activity of dentin, even after 5s. However, the best results were obtained for the longer periods.

Citotoxicidade transdentinária e efeito da carbodiimida (EDC) na biomodificação do colágeno dentinário e na degradação da interface adesiva / Trandentinal cytotoxicity and effect of carbodiimide (EDC) on dentin collagen biomodification and adhesive interface degradation

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a citotoxicidade transdentinária da carbodiimida (EDC), bem como sua influência na degradação do colágeno dentinário e na estabilidade da união resina-dentina. No estudo 1, células MDPC23 foram plantadas na superfície pulpar de discos de dentina e a superfície oclusal foi tratada por 60s com uma das seguintes soluções: sem tratamento; EDC 0,1M; 0,3M ou 0,5M; glutaraldeído 5% (GA); tampão Sorensen ou H2O2 29%. A viabilidade e a morfologia celular foram analisadas pelos testes de MTT, Live/dead, produção de proteína total (PT), de colágeno e MEV. Os dados foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (p<0,05). O GA promoveu aumento do metabolismo celular. A morte por necrose e a morfologia celular não foram influenciadas pelos agentes cross-linkers. Não houve redução na produção de PT e colágeno após 7 dias. Para o estudo 2, espécimes de dentina foram completamente desmineralizados e a variação do módulo de elasticidade (E), inibição de MMP, perda de massa, liberação de hidroxiprolina (HYP) e degradação térmica do colágeno (DTC) foram analisados após tratamento com uma das seguintes soluções por 30s ou 60s: água deionizada (controle); EDC 0,5M; EDC 1M; EDC 2M e GA 10%. Os dados referentes ao E, atividade de MMP e liberação de HYP foram submetidos aos testes de Wilcoxon e KruskalWallis ou Mann-Whitney. Os valores de perda de massa e DT foram analisados pelos testes de ANOVA e Tukey (p<0,05). Os melhores resultados quanto ao E foram observados para o GA. Todos os cross-linkers reduziram a atividade de MMP e a liberação de HYP e aumentaram a temperatura de DT do colágeno. No estudo 3, sessenta palitos de dentina foram divididos em 6 grupos de acordo com a solução de tratamento: água deionizada (controle); EDC 0,1M; EDC 0,5M; EDC 0,5M + HEMA 35%; proantocianidina 5% (PA) ou clorexidina (CHX) 2%. Após condicionamento ácido os palitos foram tratados por 60s. A atividade de MMP foi analisada por ensaio colorimétrico. Os dados expressos em valores de absorbância e em equivalentes a atividade de MMP-9 foram submetidos aos testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney (p<0.05). Todas as soluções inibiram a atividade de MMP. O EDC 0,5M e sua mistura com HEMA obtiveram os melhores resultados. Finalmente, no estudo 4, superfícies planas de dentina foram condicionadas e tratadas por 30 ou 60s com solução de EDC 0,5M ou água deionizada. Após o tratamento, o adesivo Single Bond 2 (SB2) foi aplicado e as coroas reconstruídas em resina composta. Espécimes foram produzidos e submetidos aos testes de microtração e nanoinfiltração após 24h, 6 ou 12 meses em saliva artificial. Os testes de ANOVA e Tukey (p<0.05) foram aplicados. O tratamento da dentina com EDC preveniu a redução da RU e o aumento da nanoinfiltração após 12 meses de armazenamento. Desta forma, pôde ser concluído que o pré-tratamento da dentina com agentes cross-linkers não exerceu efeito citotóxico trandentinário sobre células odontoblastóides, favoreceu as propriedades mecânicas do colágeno, foi capaz de inibir MMPs e prevenir a degradação da interface adesiva

The purpose of this study was to evaluate the trandentinal cytotoxicity of carbodiimide (EDC), as well as its influence on dentinal collagen degradation and stability of resin-dentin bonds. In the first experiment, MDPC-23 cells were seeded on the pulp surface of the disks and one of the following solutions was applied on the occlusal surface for 60s: no treatment (negative control), 0.1M, 0.3M or 0.5M EDC; 5% glutaraldehyde (GA); Sorensen buffer or 29% hydrogen peroxide (positive control). Cell viability and morphology were analyzed by MTT, Live/Dead assays, total protein (TP) and collagen production and SEM. Data were analyzed by Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests (p<0.05). Only GA increased cellular metabolism. Cell death by necrosis and cell morphology were not affected by the cross-linker agents. There was no reduction in TP and collagen production after 7 days. For the second experiment, dentin beams were completely demineralized and the variation in elastic modulus (E), MMP activity, dry mass loss, hydroxyproline release (HYP) and collagen thermal degradation (CTD) were analyzed after the dentin treatment for 30s or 60s with the following solutions: water; 0.5M; 1M or 2M EDC and 10% GA. Data from E and MMP activity and HYP release were submitted to Wilcoxon and Kruskal-Wallis or Mann-Whitney tests. Dry mass loss and CTD data were analyzed by ANOVA and Tukey's tests (p>0.05). GA group obtained the highest E values. All cross-linking agents decreased MMP activity and HYP release and increased CTD. In the third experiment, sixty dentin beams were randomly divided into 6 groups according to the treatment solution: deionized water (control), 0.1M EDC, 0.5M EDC, 0.5M EDC+35% HEMA, 5% proanthocyanidin (PA) or 2% chlorhexidine (CHX). The beams were acid etched and treated for 60s. The total MMP activity was analyzed by a colorimetric assay (Sensolyte®). Data were expressed as absorbance values at 412nm and MMP-9 equivalents and subjected to Kruskal-Wallis and MannWhitney tests (p<0.05). All cross-liking solutions inhibited MMPs. The 0.5 M EDC solution and its mixture with HEMA had the highest inhibition values. Finally, in experiment 4, flat dentin surfaces were etched and treated for 30 or 60s with 0.5M EDC or deionized water. After treatment, Single Bond 2 (SB2) was applied and the crowns were reconstructed with composite resin. Dentin specimens were produced and submitted to microtensile and nanoleakage tests after 24h, 6 or 12 months in artificial saliva. Bond strength (BS) data (MPa) were analyzed by ANOVA and Tukey tests (p<0.05). The dentin treatment with EDC did not affect SB2 immediate BS and prevented the degradation of the adhesive interface, even after 12 months of saliva storage. Thus, the dentin treatment with cross-linking agents did not exert transdentinal cytotoxic effects on odontoblastlike cells, increased collagen mechanical properties, was able to inhibit MMPs and prevent the degradation of the adhesive interface

Tempo de condicionamento da dentina hígida e afetada por cárie de dentes decíduos e permanentes: efeito na desmineralização do substrato, na produção e na resistência da união resina-dentina / Acid etching time of sound and caries-affected dentin of deciduos and permanent teeth: effect on demineralization of the substrate, production and adhesive performance of resin-dentin bonds

O objetivo geral desse trabalho, dividido em três estudos, foi avaliar a influência do tempo de condicionamento ácido na desmineralização da dentina, na qualidade e no desempenho adesivo imediato da união resina-dentina de dentes decíduos e permanentes. No estudo 1, superfícies planas de dentina foram produzidas em molares decíduos e pré-molares (n=8). Sobre cada superfície, três áreas foram delimitadas e condicionadas com ácido fosfórico por 5, 10 ou 15 s. Decorrido o período pré-estabelecido de condicionamento, o ácido foi coletado e a concentração de cálcio dissolvido da dentina (ug Ca/mm2) foi determinada por microcolorimetria. Os dados foram analisados pela aplicação dos testes de ANOVA, Tukey e análise de regressão linear (α=0,05). Correlação positiva significante foi observada entre a concentração de cálcio e o tempo de condicionamento ácido para ambos, dentes decíduos e permanentes. Para todos os tempos de condicionamento, quantidades estatisticamente superiores de íons cálcio foram detectadas para a dentina de dentes decíduos em comparação a dentina de dentes permanentes. Foi concluído que a dentina de dentes decíduos é mais facilmente desmineralizada do que a dentina de dentes permanentes, e que essa desmineralização foi maior em função do aumento do tempo de aplicação do ácido. No estudo 2, superfícies planas de dentina também foram produzidas em outros 8 molares decíduos e 8 pré-molares hígidos. As superfícies foram divididas ao meio no sentido vestíbulo-lingual por meio de uma canaleta produzida com um disco diamantado. Aleatoriamente, cada metade foi condicionada com ácido fosfórico por 15 ou 5 s e os sistemas adesivos Prime&Bond NT ou Prime&Bond 2.1 foram aplicados. Espécimes envolvendo a interface de união foram produzidos e preparados em laboratório para coloração com tricrômico de Goldner. A espessura da zona de colágeno exposta na base da camada híbrida foi mensurada em microscopia óptica e os dados submetidos a análise de variância a dois critérios fixos e testes complementares de Tukey (α=0,05). Em geral, maior exposição de fibrilas de colágeno foi observada quando o mesmo substrato foi condicionado por 15 s em comparação ao condicionamento por 5 s. Maior exposição de colágeno também foi observada em dentes decíduos em comparação a dentes permanentes, entretanto apenas quando o sistema Prime&Bond 2.1 foi utilizado. Pôde ser concluído que o aumento do tempo de condicionamento ácido dificulta a infiltração completa da zona de dentina desmineralizada favorecendo a manutenção de fibrilas de colágeno expostas na base da camada híbrida. Por fim, no estudo 3, das 24 superfícies planas de dentina produzidas em molares decíduos e 24 em pré-molares, metade foi submetida a um protocolo artificial de cárie. Nos dentes cariados, a dentina infectada foi completamente removida deixando como substrato para adesão a dentina afetada por cárie. Sobre esse substrato e também sobre as superfícies mantidas hígidas, foi realizado o condicionamento com ácido fosfórico por 5, 10 ou 15 s, seguido da aplicação do sistema adesivo Prime&Bond NT. Espécimes (0,81 mm2 ) foram produzidos para o ensaio mecânico de microtração e os dados de resistência de união (RU) foram analisados pela aplicação dos testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (α=0,05). A redução do tempo de condicionamento afetou negativamente os valores de resistência de união apenas para a dentina hígida de dentes permanentes, enquanto nenhum efeito negativo foi observado para a dentina de dentes decíduos, hígida ou afetada por cárie, e para a dentina afetada por cárie de dentes permanentes. Em conclusão, uma vez que dentina hígida e afetada por cárie coexistem na maioria dos preparos cavitários, o condicionamento ácido por no mínimo 10 s deve ser recomendado para dentes permanentes, enquanto períodos inferiores podem ser indicados para dentes decíduos

The aim of this work, divided into three studies, was to evaluate the influence of acid etching time on dentin demineralization, quality and immediate adhesive performance of resin-dentin bonds produced in deciduous and permanent teeth. In the first study, flat dentin surfaces were produced in sound primary molars (n=8) and premolars (n=8). On each surface, three circular areas were defined and etched with phosphoric acid for 5, 10 or 15 s. After the predetermined period of etching, the acid was collected and the calcium concentration (ug Ca/mm2) was determined by microcolorimetry. The data were analyzed by ANOVA, Tukey and linear regression tests (α=0.05). Significant positive correlation was observed between calcium concentration and etching time for both deciduous and permanent teeth. For all times of conditioning, statistically higher amounts of calcium ions were removed from dentin of primary teeth compared to dentin of permanent teeth. It was concluded that the primary dentin was more prone to demineralization by phosphoric acid than permanent dentin, and that the extent of demineralization increased as a function of acid etching time. In the second study, flat dentin surfaces were also produced in additional 8 primary molars and 8 premolars. The surfaces were divided into mesial and distal halves through a shallow notch produced with a diamond disc. Randomly, each half was conditioned with 35% phosphoric acid for 15 or 5 s and the adhesive systems Prime & Bond NT or Prime & Bond 2.1 were applied. Specimens involving the bonded interface were produced and processed for staining with Goldner's trichrome. The thickness of the collagen zone exposed at the base of the hybrid layer (ZC) was measured using optical microscopy. Data were submitted to threeway analysis of variance and Tukey's test (α=0.05). Overall, thicker ZC were observed when the same substrate was etched for 15 s compared to 5 s. Also, thicker ZC were seen for primary dentin when etched for the same length of time than the permanent dentin, reaching statistical significance for Prime&Bond 2.1. It was concluded that extending the etching time from 5 s to 15 s was detrimental to the monomeric infiltration of the demineralized dentin, favoring the maintenance of exposed collagen fibrils at the base of the hybrid layer. In the last study, flat dentin surfaces were produced in 24 primary molars and 24 premolars. Half of them were subjected to an artificial caries protocol using S. Mutans. In carious teeth, the infected dentin was completely removed leaving as a substrate for adhesion the caries-affected dentin. On this substrate and also on the noncarious dentin, 35% phosphoric acid was applied for 5, 10 or 15 s, followed by application of Prime & Bond NT. Beam shaped specimens (0.81 mm2) were produced for microtensile test and bond strength data were analyzed by KruskalWallis and Mann-Whitney tests (α=0.05). The reduction in acid etching time negatively affected bond strength only for sound dentin of permanent teeth. No negative effect was observed for primary dentin, sound or caries-affected, and caries-affected permanent dentin. In conclusion, since sound and caries-affected dentin coexist in the majority of the cavity preparations, at least 10 s of acid etching should be recommended for permanent teeth, while shorter periods could be indicated for primary teeth